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PKC同工酶与脑缺血关系研究进展
发布日期:2018-1-25 11:11:41 浏览次数:1621
地址:重庆医科大学附属第一医院神经内科(400016) 重庆医科大学神经病学研究所(400016) 摘 要:蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是一类由多种同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。PKC处于磷脂酰肌醇代谢的中心环节,与细胞的增殖、分化、神经传导、基因表达调节及肿瘤发生等病理生理过程有着密切的联系。近年来研究表明,PKC在缺血性脑损害发病机制中起着较为重要的作用。本文拟就PKC同工酶概况及与脑缺血关系的研究现状作一综述。 关键词:蛋白激酶C  同工酶  脑子缺血  PKC是最早被确认的蛋白激酶之一。1977年Nishizuka等首先将在鼠脑组织中的蛋白激酶确认为PKC,发现其具有组蛋白激酶活性,并能被限制性蛋白水解酶所激活。随后的研究证实,PKC在神经细胞功能的调节中,起着较为关键的作用。 1 PKC的生物学特性 1。1 PKC同工酶的分类及分布[1,2] PKC是一类钙、磷脂依赖性磷酸化酶,广泛存在于动物、微生物等有机体内,并分布在儿科所有的组织和器官中。迄今为止,根据同工酶的结构、酶的特性、激活剂的不同等将其分为四大类至少十三种PDC亚型:cPKCs(classical PKC):α、βI、βⅡ、γ;nRKCs(novel PKC):τ/η、δ、ε、θ、μ;aPKCs(atypical PKC):τ/λ、ζ;PRKs(PKC-Related-Kinase):PRK1、PRK2。 PKC分布极为广泛,各种同工酶的分布又各有其特殊性。在脑组织中至少已发现有7种同工酶存在,而PKCγ为脑和脊髓所独有;PKCδ、PKCε、PKCζ等在脑组织中含量非常丰富。 1。2 PKC同工酶的基本结构[1~5] PKC为一条单链多肽,对PKC同工酶cDNA分析表明,该多肽链氨基端序列为调节域(regulatory domain),羧基端序列为催化域(catalytic domain),两者之间通过可被蛋白酶水解的“铰链区”(hinge domain,即V3区)连接,该区在酶的激活过程中发生降解,从而使PKC活性部位暴露。调节域含有C1、C2/V0、V1和V2四个区,酶催化域含有C3、C4、V4及V5四个区。在C1的氨基端还含有假底物位点(pseudosubstrate site),PRKs无此区;PKCμ在氨基端还有引导(leader)和跨膜(trans-membrane,TM)两段序列。PKC各同工酶V1区的结构及组成的差异决定了各同工酶底物的多样性。 1。3 PKC激活和限制性调节(down-regulation)[2,3] 由于假底物的存在,静息状态下的PKC均以无活性形式存在于细胞胞浆中。在外界刺激作用下,PKC移位(translocation)到细胞膜而被激活短暂的PKC激活,在信号传导通路中所致的短期事件(如离子内流、分泌等)方面起着重要作用;持续的PKC激活,可能在细胞增殖、分化及肿瘤发生等方面起着重要的作用;异常持续的PKC激活,可导致细胞功能失调节。PKC被激活后活性下调的现象称为“PKC的限制性调节”,PKC的限制性调节可能与以下因素有关:①PKC的酶性降解:激活的PKC对Ca2+激活的中性蛋白酶(calpain)更敏感。②应激释放和/或激活内源性PKC抑制剂(如多胺、神经节苷酯等),可能参与了缺血条件下PKC活性的下调;③外界刺激信号激活磷酸酶,使膜磷脂结构、组分发生改变,影响了PKC的活性;④降解率的增加可引起PKC的限制性调节。脑氙血诱导的PKC激活,随后活性下降,可能与上述因素有关。 2 PKC同工酶与缺血性脑损害关系 在缺血性脑损害过程中,由于血液供应中断而发生一系列的细胞内代谢异常,最终导致神经元变性甚至死亡。然而,这一代谢异常的关键环节在哪里,尚不清楚。近年来人们发现PKC在其中起着较为重要的作用。 2。1 脑缺血后PKC活性的变化 在研究短暂闭塞胎盘血管对胎脑PKC调节的影响时,采用组蛋白磷酸化和PMA(PKC激活剂)结合方法发现PKC活性首先移位;当闭背地里较长时间时,PKC活性下调[6]。用(3H)PKBu放射自显影技术,观察短暂缺血(20min)及再灌流时PKC活性变化规律,发现海马CA1区放射活性增加,再灌流6~12h达最高,再灌流7d放射活性下降[7]。然而,Hara等[8]在线栓法MCAO缺血/再灌流SV-129大鼠模型中,发现再灌流1h[3H]PDBu放射活性明显减少到对侧的40~50%,3~7d后下降到对照组的20%。国外其他学者也有类似报道。有学者提出[9],出现上述实验结果的差异是由于:缺血刺激所致PKC移位可能发生在缺血早期,因而表现为PKC活性的升高;在较长时间或持续的缺血刺激后,由于有PKC限制性调节机制的参与,因而表现为PKC活性的升高;在较长时间或持续的缺血刺激后,由于有PKC限制性调节机制的参与,因而表面为PKC活性下降。当然,也可能与检测方法、动物种属及模型等因素有关。但上述结果均提示PKC参与了缺血性脑损害的发生、发展,特别是短暂性脑缺血发生后,PKC参与了缺血后的迟发生性损害和远隔部位的缺血性损害。[10] 2。2 缺血脑组织PKC同工酶的表达及基因调控 PKC与缺血诱导或谷氨酸兴奋毒性诱导的神经元变性有关,Buchner[11]等用谷氨酸、PMA作比较,观察培养海马神经元内PKC同工酶的再分布,结果发现仅有PKCα、γ对谷氨酸有应答,其他均少有应达。采用亚细胞分离术和同工酶牧民性抗体的Western blot、激光共聚焦扫描电镜免疫细胞化学观察到谷氨酸、PMA对上述两种同工酶再分布有不同的作用:PMA导致两者向膜片段移位,谷氨酸引起细胞内钙浓度增高,从而导致两者向细胞骨架移位;免疫细胞化学揭示谷氨酸引起PKCγ主要向胞浆内细胞骨架样结构移位,而PKCα再分布到胞膜和进入细胞核,后者可能揭示PKC在兴奋毒性损害中起了重要作用。Islam等[12]观察蒙古沙土鼠不全性脑缺血PKCγ的分布,发现缺血后3h,在新皮质内出现大量PKCγ阳性神经元,6~12h达高峰,7d后不能检测出,提出PKCr在海马和新皮质的这种变化规律可能与不全性脑缺血后调控突触效率有关。用Westem bolt及免疫组化技术观察狗不全性脑缺血,也发现缺血神经元损害的发生率随PKC活性的增加而增加,而且,海马CA1、CA4和小脑的PKCα蛋白表达增加,PKCβ、PKCγ无变化,说明PKC参与了缺血性神经元损害过程,且具有同工酶特异性[13]。 Savithiry等[14]采用沙土鼠短暂性缺血及再灌注动物模型,缺血后10min再灌注,运用cDNA杂交技术,检测了前脑PKC同工酶δ、ε、ζ的mRNA表达,在再灌注1、6和24h三种同工酶的mRNA表达均升高,以δ、ζ明显;3d后恢复至正常水平,并持续到第7d。Miettinen等[15]运用原位杂交技术及免疫印迹(immunoblotting)技术,观察线栓法MCAO缺血再灌流Wistar大鼠PKCα、β、γ、δ、ε、ζmRNAs及蛋白表达的变化规律:在梗塞中心缺血30min再灌充4h上述同工酶mRNA水平降低,再灌流12h完全消失;在梗塞周边区,再灌流4、12、24h仅有PKCδ mRNA水平升高,再灌流3~7d,梗塞周围区(ischemic penumbra,缺血半影区)PKCδ mRNA水平也增加,而且,再灌注其(第2d)缺血周围区PKCδ蛋白表达及阳性神经元数目均增高,且MK-801能抑制PKCδ mRNA水平及蛋白表达,因此PKCδ可能是通过调控NMDA受体而起缺血性脑保护作用。但其他学者运用RT-PCR技术及同样的动物模型(缺血5min)观察到cPKCs中仅有PKCγ mRNA水平在再灌流早期(3h内)升高达对照的145%,随后降 低60~65%,3d后回到对照水平,造成上述结果的差异,可能是因为缺血时间不同等因素所致[16];尽管如此,这些结果表明PKCδ、PKCγ可能在缺血性脑损害中起了重要作用。 2。3 PKC抑制剂对缺血性脑损害的保护作用 脑组织中含有丰富的PKC(尤其在突触前末端),它可能在神经元信息传递、递质释放等方面起着重要作用。虽然目前尚缺乏PKC同工酶特异性抑制剂,但一些工具药已开始用于探讨PKC在脑缺血病理、生理机制中的作用。于四血管结扎的大鼠缺血再灌流模型中可观察到PKC活性在颗粒片段中而不是在胞浆片段中迅速增加,其中以PKCγ水平增加明显;运用谷氨酸拮抗可使其水平降低,与缺血再灌流中谷氨酸释放的减少有关[17]。降低体温可以减少缺血诱导的PKC易位和抑制期活性,并减少缺血诱导的PKC易位和抑制其活性,并减少缺血诱导的神经递质释放。在缺血过程中,有PKC激动剂(PDBu)和拮抗剂(staruosporine)存在或缺乏时,运用微透析技术观察谷氨酸的变化情况:发现低温降低了纹状体内细胞外谷氨酸水平。脑缺血时,低温(33℃)状态下,给予PDBu后,谷氨酸的水平从0。3mumol/L升高到4。8mumol/L;正常体温下给予Staurosporine可明显减少谷氨酸水平。上述结果表明:脑缺血过程中,纹状体内细胞外谷氨酸水平的升高与温度呈依赖关系,PKC在其中发挥了重要作用;Staurosporine可通过抑制PKC的活性发挥缺血性脑保护作用,其机制可能与低温脑保护作用相似[18]。自发性高血压大鼠短暂前脑缺血模型中,运用高效液相色谱法观察PKC抑制剂对缺血诱导的氨基酸释放的影响,实验发现:双侧颈内动脉闭塞导致谷氨酸、精氨酸、牛磺酸明显增加(分别比对照增加21倍、19倍、16倍),GABA也有所增加。给予H7后上述指标分别下降到对照的3、3、4倍;HA1004对谷氨酸、精氨酸、GABA影响较小,而牛磺酸的释放能被HA1004抑制,但其作用较H7小,产生这种差异可能是由于兴奋性和抑制性氨基酸的释放机制不同[19]。上述结果显示,缺血性脑损害时PKC对氨基酸释放起着重要的调控作用,并可能具有同工酶特异性。PKC抑制剂还能减轻缺血性脑水肿,在结扎沙土鼠单侧颈总动脉及闭塞SD大鼠MCA制成单侧脑水肿病理模型中,观察两种PKC抑制剂H7和苦参碱对脑水肿的影响,发现两者对两种模型所致脑水肿均有防治作用。用PKC抑制剂Staurosporine直接注入海马CA1治疗大鼠和沙土鼠脑缺血,发现可以明显改善缺血/再灌流引起的病理变化,减少细胞死亡数,这种神经元保护作用有剂量依赖关系。 小结 PKC同工酶种类较多,是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中最庞大的一类,其同工酶的组织分布、结构、功能、活性以及基因表达的调节机制不同,并且与体内多种病理生理过程的调节有关。因此开发PKC同工酶特异性拮抗剂,将会在肿瘤、内分泌疾病,尤其是在心脑血管疾病的治疗中发挥重要的作用。 参 考 文 献 1 Mellor H,et al。Biocherm J,1998332:281 2 Nishizuka Y。FASEB J,19959:484 3 Hofmann J。FASEB J,199711:649 4 Flynn P,et al。J Biol Chem,1998273(5):2698 5 Wu SL,et al。J Biol Chem,1998273(5):1130 6 Yavin E,et al。J Neurochem,199565:2594 7 Onodera H,et al。Brain Res,1998481:1 8 Hara H,et al。Brain Res,1997774:69 9 Tohyama Y,et al。Brain Res,1997750:155 10 Harada K,et al。J Neurochem,199972(6):2556 11 Buchner K,et al。Mol Brain Res,199964(2):222 12 Islam N,et al。Indian J Physion Pharmacol,199539(1):37 13 Sieber FE,et al。Stroke,199829:1445 14 Savithiry S,et al。Mol Chem Neuropathol,199421:1 15 Miettinen S,et al。J Neurosci,199616(19):6236 16 Zablocka B,et al。Brain Res,1998779:254 17 Saluja I,et al。Neurochem Res,199924(5):669 18 Boris-Moller F,et al。Mol Chem Neuropathol,199835(1-3):133 19 Nakane H,et al。Brain Res,1998782:290
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